共聚焦顯微鏡（CLSM）具有成像分辨率高、Z軸深度分辨率高這兩個(gè)特點(diǎn)[1]。這意味著(zhù)使用共聚焦顯微鏡可以對某一區域的生物組織樣本進(jìn)行圖像顯示，并通過(guò)不斷調節Z軸深度，對一定Z軸深度范圍內的生物組織進(jìn)行成像，并通過(guò)疊加各個(gè)深度的二位成像，得到該區域生物組織的三維圖像重構圖。是經(jīng)過(guò)了很多年的發(fā)展才實(shí)現了完成顯微鏡所需的激光束掃描。經(jīng)過(guò)不斷地發(fā)展，最終實(shí)現了使用聚焦激光束對樣品進(jìn)行點(diǎn)對點(diǎn)掃描，完成二維圖像重構，再到后期的三維成像。

傳統顯微鏡進(jìn)行成像時(shí)深度分辨率較差，而使用共聚焦顯微鏡可以對樣品某一層進(jìn)行成像，具有較高的深度分辨率，進(jìn)而可以對樣本進(jìn)行三維成像。

工作原理1：

使用激光器發(fā)射出一束激光作為光源，輸出的激光通過(guò)一個(gè)物鏡聚焦在樣品表面。通過(guò)改變激光束聚焦在樣品的位置，實(shí)現激光聚焦點(diǎn)在樣品一片區域內的掃描。產(chǎn)生的熒光信號經(jīng)過(guò)一個(gè)小孔后，被光電探測器收集，小孔與焦平面處樣本成共軛關(guān)系，離焦熒光信號被濾除，使得共聚焦顯微鏡具有一定層析能力。采集激光束掃描至每一點(diǎn)時(shí)激勵光與樣本反應產(chǎn)生的熒光信號，經(jīng)過(guò)圖像重構得到該片樣本區域的熒光成像。

工作原理2：

經(jīng)過(guò)光強調節后的激勵光進(jìn)入一個(gè)由兩個(gè)可快速精密調節角度反射鏡組成的XY反射鏡組。兩個(gè)反射鏡分別對應X軸Y軸方向，通過(guò)調節兩個(gè)反射角度，使得經(jīng)過(guò)XY反射鏡組的出射激勵光在一定面積的平面范圍內按一定軌跡進(jìn)行掃描。常見(jiàn)的掃描軌跡有柵格形（Raster）掃描軌跡、螺旋形（Spiral）掃描軌跡。

掃描過(guò)程中的入射激勵光會(huì )與生物組織樣本中的熒光物質(zhì)相互作用產(chǎn)生熒光，一部分熒光會(huì )沿與入射激勵光相反的方向在先后通過(guò)物鏡和XY反射鏡組后進(jìn)入二向色鏡（Beam Splitter）中，分光鏡會(huì )反射激勵光，同時(shí)不會(huì )反射信號光，起到分離激勵光與熒光的作用。

經(jīng)過(guò)分光鏡后的熒光進(jìn)入到物鏡中再次被匯聚成為焦點(diǎn)，并在這個(gè)熒光焦點(diǎn)處加入針孔（Pinhole），此熒光焦點(diǎn)與樣本處焦點(diǎn)具有對應關(guān)系，樣本焦平面以外產(chǎn)生的熒光信號在經(jīng)過(guò)針孔時(shí)會(huì )被遮擋住，因此僅有樣本焦平面產(chǎn)生的熒光信號會(huì )通過(guò)針孔，針孔起到濾波作用，使得共聚焦顯微鏡具有深度辨析能力。

經(jīng)過(guò)針孔后的熒光信號具有較強的層析能力，同時(shí)由于光強較弱，需要使用靈敏度較高的光電探測器進(jìn)行探測。在此一般使用光電倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）將熒光信號放大并轉換為電信號，此電信號為模擬信號。光電倍增管可以在不引入噪聲的情況下將微弱的光信號放大約一百萬(wàn)倍。光電探測器輸出的電信號強度與輸入熒光強度成正比。經(jīng)光電倍增管轉換成，與熒光強度成正比的電信號隨后由模數轉換器轉換為數字信號，此數字信號對應樣本焦點(diǎn)處熒光信號強度。隨XY反射鏡組掃描，通過(guò)探測特定深度樣本區域內的熒光信號，得到每一點(diǎn)熒光強度對應的數字信號值，經(jīng)過(guò)計算機圖像處理將每一個(gè)數字信號值轉換為對應的灰度值，每一灰度信號值對應一個(gè)像素點(diǎn)，將每個(gè)灰度信號與激勵光掃描軌跡相對應得到成像圖。

共聚焦顯微鏡特點(diǎn)

共聚焦激光掃描顯微鏡通過(guò)引入小孔，使得顯微鏡具有深度分辨率，成像質(zhì)量增加。并且通過(guò)對體樣本進(jìn)行斷層步進(jìn)成像，通過(guò)后期圖像處理可以得到體樣本三維立體成像。

因為共聚焦顯微鏡為點(diǎn)掃描成像，所以其成像速度相對較慢。

共聚焦顯微鏡應用

為使用共聚焦顯微鏡對葵花花粉進(jìn)行5微米步進(jìn)斷層成像示意圖，激勵光為488nm（綠）和543nm（紅）雙波長(cháng)配合激勵，所得成像分辨率為3微米。通過(guò)將圖 4中每一層的成像按順序重組，可以得到如圖 5所示的葵花花粉三維成像圖。